Keemia osakond

Riigi teaduspreemia 2007

ELEKTROMIGRATSIOONILISED MEETODID BIOPROTSESSIDE ANALÜÜSIS

Konkursile esitatud töödetsükkel hõlmab töid aastatest 2003-2006 ja on jõudnud terviklikule kujule 2006. aastal. Töödetsüklis esitatakse uudseid lahendusi olulistele alusteaduslikele probleemidele elektroforeesis ning pakutakse uusi rakendusi elektromigratsioonil põhinevate meetodite kasutamisel keemilises analüüsis. Nendesse töödesse on panuse andnud kaks 2006.aastal kaitstud doktoritööd (Maria Kulp ja Sille Ehala) ning mitmed kaitstud magistritööd.

1. Uurimuse üldteoreetiline taust, probleemi püstitus ja uurimistemaatika
Uued elektromigratsioonil põhinevad meetodid võimaldavad otsustavalt vähendada orgaaniliste lahustite kasutamist ja alternatiivsete, ohutute lahustite juurutamist keemilise analüüsi praktikasse. Aparatuuri miniaturiseerimisega ja mitme lahutusmeetodi ühendamisega saavutatakse sünergia, mis võimaldab arendada väga aktuaalseid, kuid komplitseerituid metaboloomika- jt. bioproovide selektiivseid ja efektiivseid analüüse.

Püstitatud programmi realiseerimise käigus tõusid esile seatud ülesannete lahendamiseks kõige enam sobivad uurimissuunad: (i) kapillaarelektroforees ja kapillaar elektrokromatograafia (KE) kui uus ja arenev analüütiline tehnika, (ii) proovi ettevalmistus kasutades keskkonnasõbralikke lahusteid. Kombineerides komputeriseerimist ja miniaturiseerimist meetodite arenduses oli paljudel juhtudel võimalik saada märgatavalt efektiivsemaid analüütilisi lahendusi kui seda on võimelised pakkuma laialt levinud vedelik-kromatograafia ja massi-spektromeetria.

Uurimisgrupi tegevus oli suunatud nii uute bioanalüütiliste meetodite väljatöötamisele kui ka nende meetodite kontrollile mudelobjektidel koos sellega kaasneva teoreetilise külje läbitöötamisega:

• Uute, KE-l baseeruvate meetodite põhjendamine ja arendamine bioloogiliste objektide analüüsiks ning bioprotsesside kineetika uurimiseks;
• Mittevesikeskkondade ja uute, toatemperatuuril vedelate soolade ehk nn ioonsete vedelike kasutamisvõimaluste uurimine, sealhulgas KE analüüsiprotokollide väljatöötamine nende soolade kasutamisel elektrolüüdi komponentidena;
• Alternatiivsete, keskkonnasõbralike lahustite (ülekriitilises olekus CO2) omaduste uurimine ja vastavate ekstraktsioonimeetodite arendamine selleks, et kasutada neid bioproovide võtmiseks ja analüüsiks.

• KE instrumentaariumi ja lahutusprotokollide arendamine;
• KE rakendamine bioprotsesside seireks ja reaktsioonide kineetika mõõtmiseks;
• Alternatiivsete solventide kasutamine bioproovide töötlemiseks ja KE analüüsiks.

2.1 KE instrumentaariumi arendamine
Tänu grupi varasemale kogemusele kompuurter-kromatograafia väljatöötamisel ja arendamisel on konstrueeritud pneumaatiline automaatdosaator, mille juurutamise ja edasiarenduse käigus töötati läbi rida komputeriseeritud proovisisestuse valdkonna teoreetilisi aspekte kapillaar elektroforeesi jaoks ja pakuti mittetraditsiooniliste proovi sisestuse re˛iimide baasil uudseid praktilisi lahendusi. Üheks selliseks originaalseks lähenemiseks proovi sisestusele on füüsikast tuntud kiirete protsesside jälgimiseks mõeldud stroboskoopilise sisestuse tehnika, mis võimaldab ka KE-d kasutada kiirete (lahutuse ajaga võrreldes) reaktsioonide uurimiseks. Töögrupi poolt on välja töötatud KE tingimustele vastavad dosaatori lülitusprotseduurid ja ajalised jadad ning uuritud erinevaid suhteliselt kiireid keemilisi reaktsioone. Stroboskoopilise sisestuse meetod andis informatsiooni üksikute reaktsiooni komponentide (nii reagendid kui ka produktid) käitumise kohta, mida ei ole võimalik saada traditsiooniliste spektromeetriliste testide korral. Stroboskoopilise sisestuse kasutamine lubas lahendada olulise vedelikkromatograafia-kapillaarelektroforeesi ühendamise probleemi, kusjuures liidesena mõlema tehnika vahel kasutati pneumaatilist sisendseadet. Nimetatud pneumoseade on rakendatav KE-elektropihustus-MS analüüsi korral ja võimaldab KE-s töötada tingimustes, kus mõlemad kapillaari otsad on pidevalt kõrgepinge all.

Eelnevale lisaks pakuti lahendusi mikroliitriliste proovikoguste automaatsisestuseks, mis on erakordselt olulised piiratud kogustega bioproovide korral.

2.2 Bioprotsesside KE seire
Mõned probleemid - (i) bioreaktori või kehavedelike koostis on keerukas segu, mis ei sobi otsesisestamiseks 10-75 μm siseläbimõõduga kapillaari, (ii) elektroforees klassikalisel kujul on suhteliselt aeglane lahutusmeetod - on olnud takistuseks kapillaar-elektroforeesi kasutamisele bioprotsesside seireks hoolimata selle suurest efektiivsusest ja lihtsusest. Uute analüüsitehnikate kasutusele võtmisega koostöös erinevate uurimisgruppidega on saadud siin märkimisväärseid tulemusi mitmesuguste protsesside uurimisel:

Erinevatel tingimustel adenosiintrifosfaadi (ATP) ensümaatilise konversiooni adenosiindifosfaadiks (ADP) seirel õnnestus demonstreerida, et KE lubab ühemõtteliselt eraldada ATP signaali ADP omast ja uurida protsessi laiemas ATP kontsentratsioonide vahemikus, mida ei ole võimaldanud senised kromatograafilised meetodid. Tänu sellele selgus, et lihases toimuvate protsesside kineetika võib osutuda erinevaks sellest, mida seni arvati.

Uute sünteetiliste peptiidide oksüdeerimisel uuriti KE-ga nii reagentide kadu kui ka produktide teket ja määrati samaaegselt reaktsioonide kiiruskonstandid, kusjuures protsess toimus ilma proovi keemilise modifitseerimiseta, väga selektiivselt ja nõudis oluliselt vähem proovi võrreldes vedelikromatograafiaga.

Uuriti taimsete polüfenoolide antioksüdatiivset potentsiaali viies vastava reaktsiooni läbi sama, lahutamiseks kasutatava kapillaari sees. Siin võimaldas stroboskoopiline sisestus jälgida nende polüfenoolide segu oksüdatsioonireaktsioonis H2O2-ga reagentide/produktide koostist sõltumatult analüüsi ajast ning hinnata segu erinevate komponentide reaktsioonikiirusi üheainsa katse käigus.

Pneumosisendist ja membraansondist koosnevat süsteemi kasutati vetikate ja veekogudes lahustunud orgaanilise ainega (humiinainega) toimuvate protsesside jälgimiseks. Metallide ja humiinainete vastasmõju kineetikat uuriti kapillaari sees viies reaktsiooni läbi elektrivälja toimel. Selgitati, et humiinainetes on vähemalt kahte tüüpi tsentreid, millede vastasmõju mehhanismid metallidega on oluliselt erinevad.

2.3 Alternatiivsed lahustid.
Uurimisgrupp on omandanud suure kogemuse ülekriitilise CO2 kasutamiseks looduslike materjalide töötlemisel. Näidati, et ülekriitiline CO2 on heaks lahustiks teatud polüfenoolsetele ühenditele, mis võivad osutuda toiduainetetööstusele nii vajalike looduslike antioksüdantide allikaks. Seda tööd täiendati ka muudes protsessides kasutatavate orgaanilistele lahustitele asendajate otsimisega.

Uurimisgrupp lööb aktiivselt kaasa maailma keemiateaduses käesoleval ajal ülipopulaarsete toatemperatuuril vedelate soolade ehk ioonsete vedelike uurimisel - nende omaduste määramisel ja kasutamisvõimaluste leidmisel. Töörühmas on sünteesitud mitmeid imidasoolium katioonil põhinevaid ioonseid vedelikke. Teema läbitöötamisel on uurimisrühm saavutanud märkimisväärse kompetentsi ning on olnud pioneeriks maailmas alküülimidasoolium soolade omaduste uurimisel ja kasutamisel mittevesikeskkonnalises kapillaarelektroforeesis. Osutus, et nende soolade baasil saab valmistada sobivaid elektrolüüte mittevesilahuste elektroforeesis, mis tagavad vajaliku elektrijuhtivuse ning mõjutavad sobivalt paljude ühendite elektroforeetilist mobiilsust.

Pakuti idee kapillaarelektroforeesi ja massi-spektromeetria ühendamise korral kasutada spetsiaalseid ioonseid vedelikke puhvri komponentidena, mis peale lahusti eemaldamist töötavad MALDI maatriksitena, kus on vajalik homogeenne ja vaakumis mittelenduv, hästi UV kiirgust neelav aine. Esmased katsed selles töös näitasid, et vastavaid sooli saab kasutada elektroforeetiliseks lahutamiseks ja see asjaolu annab võimaluse edasiseks elektroforeesi ja massi-spektromeetria otseühendamiseks. Näidati võimalust kasutada ioonseid vedelikke ka teiste lahutusmeetodite nagu gaas-kromatograafia ja vedelik-kromatograafia arendamiseks.

3. Kokkuvõte
Töögrupil on teedrajav osa Eestis kapillaarelektroforeesi ja alternatiivsete lahustite (ülekriitiline CO2 ja ioonsed vedelikud) uurimissuundades ning nende baasil uute meetodite arendamisel. Võib väita, et käeolev töödetsükkel, mille põhilised tulemused on avaldatud aastatel 2003-2006 rohkem kui kahekümnes publikatsioonis, põhiliselt maailma juhtivates erialaajakirjades Electrophoresis, Journal of Chromatography jm.; kahes doktoritöös ja Eesti TA Akadeemia Toimetised. Keemia kahes elektroforeesile pühendatud erinumbris (2004, nr 1 ja 2), näitab grupi töö kõrget rahvusvahelist taset, mida kinnitavad ISI Web of Science viidatavuse andmed. Nende põhjal on grupi publikatsioonid KE alal jõudnud mõnel aastal 5% enim viidatavate artiklite hulka (aastas avaldatakse KE alal ~2000 tööd). Eestis viimasel viiel aastal tehtud tööde puhul, mida refereerib ISI andmebaas, on osa töörühma publikatsioone jõudnud 1% enimviidatavate artiklite hulka (ISI andmebaas refereerib ~4000 Eestis töötavate autorite tööd). Töö tulemusi on suuliselt ette kantud paljudel rahvusvahelistel konverentsidel ja Tallinnas organiseeritud esinduslikul jätkusuutlikule keemiale pühendatud sümpoosionil. Töögrupil on tihedad sidemed mitmete rühmadega välismaa ülikoolides – Duke Ülikool, Durham, USA; Lõuna-Illinoisi Ülikool, Carbondale, USA; Nottinghami Ülikool ja Yorki Ülikool, UK; Åbo Akademi Ülikool, Turu ja Kuopio Ülikool, Soome; Stockholmi Ülikool, Rootsi; jt, ning need on leidnud kajastust ka ühispublikatsioonides. Käesoleva uurimistöö tulemused on kergesti rakendatavad mitmesugustes kontroll-laborites ja võivad aidata tõsta nende konkurentsivõimet maailmas. Kohalike bio- ja meditsiinianalüüsiga tegelevate uurimisrühmade huvi on juba suur ning suure tõenäosusega leivad need uued analüüsimeetodid laialdasemat kasutust.